DNA抽出実験法 （東レ理科教育法受賞作品，啓林館生物Ⅱ指導書より） 準備 材料；凍らせた鳥のレバー 薬品；0.3％トリプシン水溶液（ｐH７のリン酸緩衝液に溶かすのが望ましいが水道水でもよい。室温で放置すると自分自身を消化してすぐに使用できないものになる。氷冷しながら調整し，使用するまで氷水につけておく。氷冷すれば半日ぐらいは気にならない。保存するときは冷凍する），２mol/l 食塩水，エタノール，氷 器具；おろし金，乳鉢，乳棒，ガーゼ，ビーカー，ガラス棒，ロート，ガスバーナー，三脚，金網，試験管ばさみ 手順 冷凍レバー ５～１０ｇをおろし金でおろす。 乳鉢にレバーを入れ，トリプシン液 １０～１５ｃｃを加え，よくすりつぶす。 食塩水を等量加えて,軽く混ぜる（食塩水の最終濃度が１mol/lより下がらないようにする）。 ビーカーに移し１００℃で５分間湯煎する（タンパク質が凝固し，レバーが白色になる。電子レンジで加熱してもよい）。 手で触れるようになったら ４枚重ねのガーゼでろ過する（しっかり絞ること）。 ろ液をよく冷やして，氷冷したエタノールを入れ，ガラス棒でかきまぜる（不純物のためDNAの色は赤い）。 できる限り巻き取ったものを 再び食塩水 ２０～３０ccに溶かす。 再び湯煎する。熱いうちにろ紙でろ過する。 ろ液にエタノ－ルを入れ（境界面に雲のような沈殿が見える），ガラス棒でかきまぜる。 結果 DNAの確認 抽出したDNAを少量の水に溶かす。 キャピラリーを用いて,ろ紙にプロットする 細胞核を染色する液で５分程度染色。 熱湯で洗って脱色。 プロットしたところが染色されている。 染色液 酢酸オルセイン，ギムザ液，メチルグリーンなど。 白子からDNAを抽出する 『いきいき生物のびのび実験』（新生出版，1999年）：64-65． 材料 白子（タラの精巣．冬になると鍋物の材料として出回る．精子には細胞質がほとんどなく，染色糸の塊といってよいので，簡単な方法でDNAが抽出できる－宮崎貞子） 薬品 10％塩化ナトリウム水溶液１０ｍｌ，冷エタノール２０ｍｌ，0.02％メチレンブルー水溶液 用具 乳棒と乳鉢，駒込ピペット，試験管，ビーカー，ピンセット，スポイト，顕微鏡および観察用具 方法 白子を約１ｇ乳鉢にとり，すりつぶす． 塩化ナトリウム水溶液を少量加え，さらによくする．トロロ汁のような粘りが出てきたら，残りの 塩化ナトリウム水溶液を加え，さらにすり混ぜる． 試験管に移し，しばらく静置する． 試験管の上の方の液を駒込ピペットで取り，冷やしたエタノールに静かに滴下する． 底に沈んでいる膜状の物質をピンセットで引き上げ，エタノール中で振ってみる．糸状の物質がくっつきあって出来ていることが分かる． メチレンブルーで１分ほど染色し，水洗した後，顕微鏡で観察する． 結果 色が濃く染色され，繊維状の構造の部分が主にＤＮＡである． 不定形の部分は染色糸を作るタンパク質との混合物であると思われる． ハードコンタクトレンズ用洗浄保存液によるDNA抽出法 中山生欧・前川洋 『生物教育』1998年38巻2号 58-62頁 材料 マダラ Gadus macrocephalus TILESIUS の精巣 （および市販のブロッコリーのつぼみ）  薬品 0.9％NaCl－0.01Mクエン酸ナトリウム溶液、ハードコンタクト洗浄保存液（陰イオン系界面活性剤、緩衝剤、EDTAなどを含む） ２M NaCl溶液、クロロホルム、エタノール、アセトン 用具 試験管、大型試験管（25×300）、ゴム栓、乳鉢、乳棒、駒込ピペット、 パスツールピペット、 メスシリンダーまたはメートルグラス 実験方法 準備 マダラ精巣（白子）を冷凍する (1)冷凍したマダラの精巣を0.2ｇを乳鉢に入れてすりつぶす。(＊註1) (2)乳鉢にNaCl－クエン酸ナトリウム液を８ｍL加えてよくまぜる。 (3)大型試験管にハードコンタクト洗浄保存液を２ｍL入れておく。（＊註2） 乳鉢の液をピペットですいとって全部を大型試験管に入れゴム栓をする。 (4)大型試験管を手で温めながら3～４分間よく振って混ぜる。 (5)２M NaCl溶液を20ｍL加え約２分間よく振り混ぜる（＊註3） (6)クロロホルムを１０ｍL加える。 ２～３分間試験管を静かにゆっくりと横にしたり立てたり（シーソー運動）する。 ゴム栓はときどきはずして、中の気体を逃がす必要がある。 あまり激しくシーソー運動をすると上層全体が白濁するので気をつける。 (7)３～８分間放置する。下層（クロロホルム層）に脂質が溶解してくる。 (8)上層にある半透明な部分（核酸のある層）を２～３ｍLを駒込ピペットで別の試験管に取る。 上層と下層の間の白濁した部分（変性したタンパク質の層）は吸わないようにしなければならない。 これが粗DNA抽出液である。（註4） (9)冷凍庫で冷やしたエタノールをピペットで壁づたいにそっと注ぎ、それぞれの粗DNA抽出液の上に層をなすようにする。注ぐ量は粗DNA抽出液の約２倍量。（註5） (10)細いガラス棒でエタノール層と粗DNA抽出液の界面をゆっくりかき回し、徐々に下層の液とエタノールを混ぜながら、細いガラス棒に粗DNAを巻きつける。  巻き取ったDNAを冷蔵庫で冷やしたアセトンで洗浄する。 (11)シッフ試薬で染色してＤＮＡであることを確認する。 
註1 0.2ｇより多くしてもよい。タラの白子では、0.6ｇくらいでも問題なかった。つぶしきれなかったり溶けきれなかったりして、カスが多くなるが、(8)で余分なカスを吸わなければ問題なかった。つぶし方や(2)の混ぜ方が不十分な班は収量が少ないので、その危険率を見積もってやや多くしてもよい。 しかし、2004年にサケの白子で実験したところ、0.2ｇより多くすると粘性が大きくなってしまい、（８）で透明層を取ることが難しかった。サケの白子での収量は精巣重量の6％くらいであった。（池田）。 註2 緩衝剤入りの界面活性剤が含まれるのでSDS代わりである（池田）。 註3 NaClはDNAをよく溶かす作用をする。 註4 30×250の試験管で実験したところ、上層と白濁層の境界が分らなかった。しかし、そのときも液の一番上の層を1～2ｍL程度取るようにする（池田）。 註5 エタノールはDNAを沈殿させる。低温ほど効果がある。エタノールを注ぐとすぐに境界面に細いもやもやとした糸状のものが立ち上がる。これが目的のDNAである（池田）。 結果 白い糸のような塊ができた。班によっては収量不足もあった。 考察 精巣には精子が満たされている。精子は核が中心なのでDNAが豊富である。 見たところでは、精巣量の20分の１程度のDNAが得られたようだ（2003年）。今度実験する際には正確に収量を測定しておきたい。 2004年のサケの白子での収量は精巣重量の6％くらいであった。 （冷凍させたブロッコリーのつぼみの処理はマダラと異なる。原論文は50分の時間に両方を平行して実験して、動物にも植物にもＤＮＡがあることを確かめる展開である） 植物体からのDNA抽出 森屋一・斉藤隆政・山川宏・鈴木恵子・興座功子 『とっておき生物実験』（遺伝別冊No.70，掌華房，1998年）：147-150 入手しやすい野菜を使い，グラスロッドで粗DNAを釣り上げるまでの簡便法． 核DNAのほか，ミトコンドリアDNA，葉緑体DNA，RNAなどが混ざったものである． １．準備する試薬類 （１）液体窒素 業者から購入 （２）DNA抽出液 純水に 20ｍM EDTA と 1.4M NaCl 100mM Tris-HCl （ｐH＝8.0）を溶かす． ｐHを8.0に合わせ，オートクレーブにかけ，さめてから， 2％CTABと0.2％ ２－メルカプトエタノールを溶かす． （３）クロロホルム試薬 クロロホルム：イソアミルアルコール＝２４：１ の混合液 （４）イソプロパノール ２．グラスロッドの作製 パスツールピペットの先端をガスバーナーであぶってふさぎ，さらに先端から約１cmの位置をあぶり，フック状に曲げて作る． ３．操 作 （１）乳棒と乳鉢を－20℃の冷凍庫に入れ，30分以上冷却しておく（冷却せずに液体窒素を入れると割れる）． （２）10ｍｌのＤＮＡ抽出液を50ｍl容量の遠心管に入れ，60℃の湯浴であらかじめ温める． （３）約２ｇの植物体をハサミできざみ，乳鉢に入れる． （４）軍手を着用し，乳鉢に液体窒素を10ml程度加えて植物体を凍結し，植物体が抹茶状の微粉末になるまで液体窒素を適宜補充しながら，乳棒ですりつぶす． （５）微粉末をあらかじめ温めた遠心管に入ったDNA抽出液に懸濁する． 微粉末がダマにならないように加える．ただし激しく混ぜてはいけない． （６）振とうしながら，60℃で20分間温める．ここでも激しく混ぜてはいけない．激しく混ぜると，DNAが切れて釣り上げられなくなる． （７）10mlクロロホルム試薬を遠心管の管壁づたいにゆっくりと加える．次に、遠心管にふたをし、水層とクロロホルム層を遠心管を横にした状態で，手でシーソー運動により５分間混ぜる．これは植物のタンパク質やポリフェノールを除くために行う． （８）室温で3000rpm，５分間遠心分離する． （９）遠心が終わった段階で，遠心管の内容物は，上から順に水層（DNAを含む），植物体の残骸，クロロホルムの３層から成る． 植物体の残骸やクロロホルム層を決して吸わないようにして，水層だけを駒込ピペットで試験管に移す． ここでも操作はゆっくり，ていねいに行い，試験管に入れる時は管の底もしくは液面にピペットの先端を付けてDNA溶液を出す． （10）７mlの－20℃に冷却したイソプロパノールを試験管の管壁づたいに加え，試験管にふたをし，やさしくシーソー運動させて，溶液をよく混ぜる．溶液を混合すると白いものが析出してくる．これが粗DNAである． （11）グラスロッドで，粗DNAを巻き取る． 液体窒素が無い場合はドライアイスを板状に切り，間に材料をはさむと，数分でカリカリになる．冷却しておいた乳鉢と乳棒で材料をすりつぶす．途中で溶けてきたら，ドライアイスで直接冷やす．（６）以降は同じ． 液体窒素もドライアイスも無い場合は，（１）から（５）の代わりに，植物体をハサミできざみ，乳鉢に入れる．10mlのDNA抽出液を少しずつ加えながら乳鉢で植物をすりつぶす．この後は（６）の操作を行う． ４．植物材料 DNA抽出量は，核密度が大きいほど，細胞が柔らかく破砕しやすいほど多いと考えられる． 芽や若い葉，つぼみなどがよいと思われる． ブロッコリーは先のつぼみ部分，ダイコンは葉の部分，モヤシは緑豆の芽生えのわずかに出ている本葉の部分を使用する． 表．植物材料の検討 植物体２ｇから，乾燥重量で◎；3mg以上，○；2mg以上，△；0.5mg以上，×；0.3mg以下．
５．抽出されたDNAの確認 １）フォイルゲン反応 赤色に染色される．比較対照として毛糸，木綿糸などを染色してみる． ２）ジフェニルアミンとの反応 ジフェニルアミンはＤＮＡ塩基と結合していたデオキシリボースと反応して青色になる． 試薬は１ｇのジファニルアミンを2mlの濃硫酸に溶解し，98mlの氷酢酸を加えて作る． 試薬を数mlと釣り上げたDNAを試験管の中に入れ，沸騰水中で10分間ほど加熱する． ３）吸収スペクトル 釣り上げたものをアルミホイル上で風乾し，１Ｍ ＮａＣｌ水溶液中に１mg／10mlほどの濃度で溶かして分光光度計で200～300nmの吸収スペクトルを測定する．核酸の塩基の吸収紫外線260ｎｍにピークを持つ．タンパク質のピークは280nmである． 謝辞 横浜市立大学木原生物学研究所・笹隈哲夫先生をはじめとする先生方に，横浜バイオテクノロジー懇談会主催の実習会において，教えていただいたものを教材化したものである． 超カンタン DNA 抽出法 実習前に確認 抽出に使う薬品の働きを確認しておきましょう 1モル濃度～2モル濃度の食塩水 【DNAをよく溶かす】 界面活性剤 【細胞膜とタンパク質を破壊する】 専門家はSDSという薬品を使います。 家庭用洗剤やハードコンタクトレンズ洗浄剤で代用します。 エタノール 【DNAを沈殿させる】 温度が低いほど効果があります。冷凍庫で冷やしておきます。 実験Ⅰ 植物 ブロッコリーからのDNAの抽出 用具 乳鉢、乳棒、茶こし、ビーカー（50ｍL，100ｍL）、割りばし 薬品 食塩、界面活性剤（30％ 中性洗剤）、冷蔵したエタノール 材料 ブロッコリーのつぼみ （小分けして冷凍しておくこと） 方法 （１）冷凍したブロッコリーを５ｇ 乳鉢に入れる （２）DNA抽出液を作る 100ｍLビーカーに水を20ｍL取る 食塩を2.5ｇ入れて割りばしでかきまわし、よく溶かす 洗剤を2ｍL 加える できあがった抽出液の半分、約11ｍLを 50mLビーカーに分ける。50mLの方に分けた抽出液は実験２で使います。 （３）細胞を破壊する 乳棒でブロッコリーを押しつぶす。 ■乳棒はたたかずに、押して回して使います。 ★たたくと割れてしまう危険があります。 抽出液を３分の１程度加える。さらに３分ほど押しつぶす 抽出液を加えて、さらに３分ほどおしつぶす。 また残りを加えて、さらに３分ほどおしつぶす。 （４）つぶした液を茶こしで濾す。 淡緑色の液がビーカーにたまる （５）冷凍したエタノールを約10ｍL加える。5秒ほどすると・・・ （６）白い糸状のDNAが析出してくるので、割り箸で静かにすくい取る 考察 なぜ材料としてブロッコリーを使うのでしょうか。 ブロッコリーの食用部分は主に【つぼみ】です。 この部分は細胞分裂が盛んでDNAの割合が多いと推測されるからです。 植物細胞は動物細胞に比べてDNAの抽出の邪魔になる タンパク質の割合が低いため、実験に適しています。 冷凍するのはなぜですか。 冷凍すると凍ることによって、細胞が【破壊される】から。 実験２ 動物 タラの白子からのDNAの抽出 用具・薬品 実験１と同じ 材料 タラの白子（精巣） （小分けして冷凍しておくこと） 方法 （１）冷凍した白子を５ｇ 乳鉢に入れる （２）DNA抽出液、前の実験１で50ｍLビーカーに取ったDNA抽出液を準備 （３）細胞を破壊する 乳棒で白子を押しつぶす 抽出液を３分の１程度加える。３分ほど押しつぶす 抽出液を加えて、さらに３分ほどおしつぶす また残りを加えて、さらに３分ほどおしつぶす （４）つぶした液を茶こしで濾す。淡い白い液がビーカーにたまる （５）冷凍したエタノールを約10ｍL加える。5秒ほどすると・・・ （６）白い糸状のDNAが析出してくるので、割り箸で静かにすくい取る 考察 なぜ材料として白子を使うのでしょうか。 白子は【精巣】です。この部分には精子が多く含まれています。 精子は細胞中の核の割合が大きく、DNAの抽出に適しています。 ただし、植物細胞に比べてタンパク質の割合が高いため、 最後に取り出したDNAの糸の周囲に不純物として、透明なタンパク質が付着しています。 参考ウエッブページ www.aichi-c.ed.jp/contents/ rika/koutou/seibutu/se5/dna/dna.htm http://www.keddy.ne.jp/~scitech/dna/exp02.htm www.ed.gifu-u.ac.jp/~koho/info/jissen/pdf/0706.pdf |