神奈川県理科部会紀要 2001年5月 14-16ぺージ
【紀要には原稿をフロッピーで投稿しているのだが，考えられないほどたくさんの誤植があった！】
生物発光実験 神奈川県立足柄高等学校 池田博明 足柄高校では毎年２学期の中間テスト期間に地元の南足柄中学校の3年生を招待して体験授業を実施している。もともと中学校側の要請によって始まった行事だが，今年は３年目に入って定着した感がある。2000年度は9講座を開設し，中学生120名を迎えた。講座の内容は高校側で自由に設定し，講座内容を中学生に提示して，中学側で生徒の希望を取って参加して来る。実施方法は，以前に全県的に県立青少年センターで行っていた中学校体験活動教室の地域版のようなものである。 私は足柄高校に異動したばかりで，この講座を担当するのは初めてであった。開講に当り，これまでに高校３年生に実施した生物の生徒実験の中で，もっとも生徒に人気の高い生物発光実験を中心に60分程度の実験授業を組み立てることにした。下記はその展開である。 中学生に限らず，高校生でもほぼ同様に展開できる。 ウミホタルを使って行う実験に関しては，できるだけ少量のウミホタルで大きな効果をあげることのできる工夫をした。例えば，第一学習社や啓林館の図解生物では，すりつぶしたウミホタルを試験管に移すという方法を紹介している。しかし，実際にこの方法では多量のウミホタルが必要で，費用がかかりすぎてしまう。加熱方法も不確実であったので改良を加えた。 実験後，実験授業に参加した中学生の代表から礼状をもらった。その一部には「ウミホタルという生物の実物を見たことがなかった私たちは、その発光の様子を見て，とてもきれいで感動しました。先生の説明が丁寧でわかりやすく楽しい授業でした」とあった。 なお，実験の準備に際しては本校の井上民子先生，海浦隆典先生，長崎美和先生，前教諭・水上慶文先生のご助言・ご協力を得た。 材料 乾燥ウミホタル（業者から購入する。5班で実験して1．5本程度の消費），ホタライト（業者から購入する。1回分が2000円） 用具（班当り） ルーペか双眼実体顕微鏡 1台，ピンセット1本，乳鉢1個，乳棒1本，試験管4本，試験管立て 1台。 （教室当り）ワイングラス 1個，水1リットル，50mlビーカー，加熱器具， 直視分光器 4台程度，ナトリウム光源1台， 三原色光混合装置（水上慶文先生製作。赤・緑・青の色セロファンを用いて，スイッチを分け，色光混合演示を可能にした装置）。 展開方法 事前準備：部屋の暗幕を引いておく。実験台には双眼実体顕微鏡。実体顕微鏡のステージには薬包紙をセット。 発問1."海に住んでいて発光するのでウミホタルと呼ばれている動物は，次の生物のうち，なんの仲間でしょうか？ アメーバ？ 昆虫？ ミジンコ？" 答"ミジンコ" 実験1.ウミホタルの観察 乾燥ウミホタルを薬包紙上に配り，双眼実体顕微鏡（またはルーペ）で観察する。 観察結果からの答え "ウミホタルはミジンコの仲間です。 ちなみにゲンジボタルやヘイケボタルは昆虫，夜光虫は原生動物です" 発問2."このウミホタルを発光させるには，どうしたらいいでしょうか？" 答"すりつぶして，水を加えます。つまり体の中にある発光素を外へ出してやります" 実験2.ウミホタルの発光実験 1） 乾燥ウミホタルを15匹，乳鉢に入れ，すりつぶす。 2） 駒込ピペットで，1mL水を準備する。 3） 消灯して，真っ暗ななかで，水1mLを（1）の乳鉢に入れる。青白く発光する。 4） 乳棒で発光しなくなるまでかき回し続ける。発光持続時間を測定してみる。 ていねいにかき回すと5分近くも発光が持続した。 発問3."発光素が無くなりました。 もう一度ウミホタルを加えてすりつぶしてみましょう。" 5)消灯したまま，ウミホタルを数匹加えて，乳棒ですりつぶす。 再び青白く発光する。 6）点灯し，これを試験管に移し，A液とする。 7）その後，乳鉢と乳棒はよく水洗し，きれいにふいておく。発光物質が乳鉢や乳棒に残らないように注意する。 発問4."ウミホタルには，熱に強い発光素と，熱に弱い発光補助物質（発光酵素）が関係しています。熱に弱い物質を壊す目的で，ウミホタルを煮てみましょう" 8）50ｍｌのビーカーに水を20ml入れて沸騰させる。お湯がわくまでの間に，ルシフェリンとルシフェラーゼの話をする。 9）沸騰後，ウミホタルを1班当り約15匹入れて1分間煮る。 10）乳鉢に煮汁とともにウミホタルを分ける。 消灯する。 11）乳棒で煮たウミホタルをすりつぶす。発光しないことを確認する。これをB液とする。 発問5."A液は加熱していないので，A液には発光酵素が壊れずに残っているはずです。B液の発光酵素は壊れてしまいましたが，B液はまだ一度も発光していないので，こちらには発光素が残っているはずです。乳鉢のB液に試験管のA液を加えてみましょう" 12）B液にＡ液を混合すると，発光する。 点灯する。 発問6."いま見たウミホタルの発光色はなんと表現しますか。光色が違うと何が違うのでしょうか" 解説："ウミホタルの発光素ルシフェリンは化学的にはイミダゾピラジノン誘導体である。類似の発光素にはホタルイカ，発光クラゲ，発光魚がある。イミダゾピラジノン誘導体は海の生き物の発光素といえよう。陸の生き物ではホタル類の発光素はD-Cys誘導体で，発光キノコや発光バクテリアの素はフラビン系である。 一方，ウミホタルの発光酵素はアミノ酸残基555個から成る，分子量約62000の糖タンパク質。発光色は，460nm（青色）である。 ホタルの発光色はホタルの種によって異なっており，ルシフェリンの構造は共通なので，発光酵素に種特異性があると思われる" 実験3.光色と電磁波 消灯する。 三原色混合装置を使い，三光ともONして白色光を作る。 1）三原色光混合装置の白色光を直視分光器で見せる。 2）同様に三原色の各単色光を直視分光器で見せる。 3）ナトリウム光を直視分光器で見せる。（ナトリウム光は点灯後数分しないと安定しない） 解説："ナトリウム光は気体上のナトリウムを充填したもの。気体のナトリウム原子は特定の波長の光を出し（吸収せず），他の波長の光を吸収する。ナトリウムのオレンジがかった黄色のD線は厳密には2本の線＝589.0nmと589.6nm" "光の色と電磁波の波長について説明する" 実験4.ホタルの光を観察する。 ホタライトの解説。 "ホタルはいない時期であるが，ゲンジボタルの発光器の酵素生産遺伝子を大腸菌に移して，遺伝子組換え技術で大腸菌が生産した酵素をもとにした製品である" 1）生徒の代表に，ホタライトA剤の袋に水50mlを加えさせ，チャックをした後で，バックの外からゆっくりともむようにして，粉末を完全に溶解させる（これをA液とする。ルシフェラーゼ入り） 2）別の生徒にはホタライトB剤の袋で同様に，粉末を完全に溶解させる（これをB液とする。ルシフェリンとATP入り）。 3）両液を班毎に1mlずつ別々の試験管に配布する。 消灯する。 4）実験台上でA液とB液を混合させ，発光を確認する。 5) 残った溶液を同量ずつワイングラスに混入してみる。 6) 直視分光器で発光を観察し，確認してみる。 ホタライトの発光色は黄緑色であるが，特定波長のところだけでなく，連続スペクトルが確認された。 遺伝子組換え技術について生徒に解説する。 ホタライト（Phota lite）はキッコーマン株式会社・バイオケミカル事業部企画グループが，遺伝子組み替え技術を使って酵素ルシフェラーゼの大量生産を可能にして製作した実験キットである。 取扱説明書よりホタライトの生産概要を転記しておこう。 1）ゲンジボタルの発光器からルシフェラーゼ遺伝子のコピーのｍRNAを抽出する。 2)逆転写酵素などを用いてルシフェラーゼ遺伝子のｃDNAを合成する。 3)運び屋（スリーパーベクター）のルシフェラーゼの設計図をつなぐ。 4)微生物（大腸菌）の染色体に組み込むと，スリーパーは寝たままで菌だけが効率的に増殖する。 5)移植された設計図が自動的に大腸菌の遺伝子の500〜1000倍に増え、目的のルシフェラーゼが一挙に大量生産される。 ホタライトは，ルシフェラーゼを使って，ATPの有無，つまり生物の有無を検出できるので，調理室の清浄さを検査する試薬として利用されている。 質疑応答 ｢ホタルの発光は雌雄の求愛コミュニケーションですが，ウミホタルはなんの目的で発光しているのですか｣ "天敵を驚かすためと考えられています。光ることによって，天敵がひるんでいるすきに逃げるということです。生きたウミホタルでは負の光走性があるそうです。集団で光るときにも暗い方に逃げる適応になっているのかもしれません。 オスが弱い発光をしながら光ることも知られています。この場合は求愛の信号となっていると思われます。" 「ウミホタルは日本特産ですか」 "発光するウミホタルは各地に生息していますが，ここで使用している日本のウミホタル（Vargura hilgendorfii ）は日本近海でしか発見されていないそうです。発光量は仲間うちでは最も強いそうです" ｢発光色はどのような物質で決まっていますか｣ "ルシフェラーゼで決まっています。インドネシア産の黄色い発光をするウミホタルのルシフェリンと日本産のウミホタルのルシフェラーゼを反応させると，青白い光色になり，日本産のルシフェリンとインドネシア産のルシフェラーゼでは黄色い光色となります。" 参考文献 阿部勝巳，1994.海蛍の光.筑摩書房.214ｐ. 丹羽治樹，1996.発光反応.遺伝，50（11）：35-41. 近江谷克裕，1996.生物発光システムにより生体情報を読む.遺伝.50（11）：9-10。 近江谷克裕，1996.発光酵素ルシフェラーゼの構造.遺伝，50（11）：30-34. 太田次郎（監），2000.図解フォーカス総合生物.啓林館. 田中隆荘・田中昭男，2000.新編図解生物.第一学習社， 羽根田弥太，1972。発光生物の話。北隆館. ホタライト取扱説明書. |