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       緑葉のペーパークロマトグラフィー      啓林館 生物TBより

仮説1 「緑色植物はクロロフィルaを持つ」

仮説2 「赤ジソの葉はシソの大葉と共通の色素を持つ」

材料 大葉,赤ジソ またはホウレンソウやツメクサ
用具 ペーパークロマトグラフィー用ろ紙,ペークロ用シリンダー(または50mlのメスシリンダーか,試験管),切り込みを入れたゴム栓,乳鉢・乳棒,定規,毛細管,鉛筆,ドライヤー
薬品 色素抽出液(アセトンとメタノールの1:3の混合液),展開液(石油エーテル:トルエン=7:3の混合液)
   展開液の成分中トルエンはシンナー遊びの材料なので別液がある。
     → 石油エーテル:石油ベンジン:アセトン= の混合液

方法
1)葉を細片にして乳鉢に入れ,色素抽出液を加えて乳棒で押しつぶすようにし,色素を溶かし出す。
2)ろ紙の原点に抽出液を細いガラス管(毛細管)で,小さな点状に付ける。これを何回か繰り返して,抽出液を濃くする。
 別法
  1)ろ紙の下から3cmのところに原線を鉛筆で軽く引く。
  2)原線の上に葉を載せ,爪楊枝の頭を葉の上から押しつけて,ろ紙に葉の汁を付ける。これを繰り返してできるだけ濃く付ける。
3)ドライヤーで抽出液を乾燥させる。註:水分が残っていると色素の分離が悪い。
4)シリンダーに展開液を入れるが,このときペークロ用ろ紙を入れたときに原点が液に浸かってはいけない。液の上面から1cm以上はあくようにろ紙の長さや液量を調節する。
5)ゴム栓にろ紙をはさみ,下端を1cm程度展開液に浸して展開する。ろ紙がまっすぐ立つようにする。
6)展開はシリンダーの長さにもよるが15分程度か。
7)ろ紙を展開液から取りだし,すぐに前線に鉛筆で印を付ける。色素斑にも鉛筆で印を付ける。
8)各色素の原点(または原線)からの移動距離を,原線(または原点)と前線間の距離で割って,色素ごとに移動率Rf値を求める。
9)色素の色とRf値から各色素の名前を決定する。

結果例  石油エーテル:トルエン=7:3の場合

色素 βカロテン ビオラキサンチン キサントフィル クロロフィルa クロロフィルb
Rf値 0.98 0.47 0.34 0.29 0.17
橙黄色 黄色 黄色 青緑色 黄緑色


              薄層クロマトグラフィー

方法 多様な植物の光合成色素を薄層クロマトグラフィーで分析する。
材料 ランソウ類   ユレモ Oscillatoria sp. (排水溝から採取)
    紅ソウ類    乾海苔 Porphyra sp. (市販の商品)
    褐ソウ類    ワカメ Undaria pinnatifida (湾で採集)
    緑藻類     アオミドロ Spirogyra sp.  アナアオサ
    コケ植物    ジャゴケ Conocephalum conicum
    被子植物    セイヨウカラシナ Brasssica Juncea

   (硫酸ナトリウムを加えて磨砕した試料をチャック付きポリ袋に入れ、フリーザーで凍結保存できる)

用具 Merk社のアルミニウムシート (25 TLC aluminium sheets Silicagel 60) 
   (切断して使用する)

方法 (1) 展開槽の準備
      試験管(φ13×180mm)に展開溶媒1mLを入れ、シリコン栓で密栓しておく
    (2) 試料 約 0.3gをはさみで細かく切り刻んで乳鉢に入れ、
      約 1.5gの硫酸ナトリウムを加え、全体が白っぽくなるまですりつぶす。
    (3) 試料を薬包紙の上に集め、マイクロチューブ半分に移す。
        ジエチルエーテル 約 0.8mLを加えてふたをし、数回振った後、10分間放置する。
    (4) 縦 10cm 横 1cmに薄層プレートを切り分ける。
        プレートの下端から2cmのところを原点とする。8cmのところを終点とする。
    (5) ピペットチップを用いて、薄層プレートの原点に色素抽出液を滴下する。
        スポットが大きくなり過ぎないように注意する。
    (6) 展開槽に入れて展開し、終わったらすぐに取り出す。
    (7) 色素を記録する



結果 どの植物からもカロテン・キサントフィル・クロロフィルa・クロロフィルbが分離された。
    各色素のRf (rate of flow)を求める。

参考文献
 畦浩二,2003.光合成色素の定性分析から植物進化を考察する実践的研究.生物教育,44(1):10-18
 高桑純,2001.光合成色素の分析により植物の進化と多様性を考えさせる教材の開発.生物教育,42(2):65-73.

              薄層クロマトグラフィーのRfと展開時間

目的  高校理科実験での、Rf値と展開時間の関係を知る

材料および方法
 材料
 ツバキの緑葉1枚(約0.8g)をハサミできざんで乳鉢に入れ、約2gのシリカゲル粉末、約0.05gの塩基性炭酸マグネシウムとともに摩砕した。これをスクリュー管に移してから冷凍保存した。
 シリカゲル粉末は乾燥剤シリカゲルビーズを乳鉢で砕いてから乾燥機で乾燥させたもの。
 炭酸マグネシウムはクロロフィルの分解を防ぐ。

 薄層プレート
 シートは塗布方向に沿って両端のみ幅1mm程度欠けた部分がある。塗布方向に沿って展開する。
 カッターナイフで2cm幅に切り分けた。原点は下から2cm、展開距離は10cm、終点は下から12cm。
 薄層の乾きぐあいをそろえるには、電気乾燥器で110℃、1時間加熱する。
 複数の試料を同時展開するときは、シートの下端および両端を3mmほどスパーテルで掻きとっておくと溶媒が一様に展開するのでよい。

 展開槽
 試験管(直径30mm、長さ19cm)にシリコン栓(ゴム栓またはコルク栓でもよい)
 2cm幅(長さ10cm)に切ったろ紙を入れると、長さを変えて飽和度をそろえることができる。

 展開溶媒
 石油エーテル:アセトン=6:4  使用の直前に用意し、展開槽に約1cmの深さで入れておく。

 色素の抽出
 摩砕した試料を約0.3gを薬さじでプラスチック製のエッペンドルフ試験管(容量2mL)に移し、ジエチルエーテル約0.5mLを加えてミクロスパーテルでよく攪拌後、ふたをして静置する。数分後に生ずるうわずみを用いる。

 色素の添着
 ガラスの毛細管で原点に5回前後添着。

 展開
 下端1cmを展開溶媒に浸して展開

結果
 ツバキの緑葉からはカロテン、クロロフィルa、クロロフィルb、ルテイン、ビオラキサンチン、ネオキサンチンの6種が分離できた。

 展開時間が短いとRf値は小さく、中に入れるろ紙を長くすると展開時間が短くなる。
 20℃までは温度の影響(5〜20℃)はあまり無かった。石油エーテルとアセトンの混合比を7:3にすると、Rf値がやや小さくなる。
 石油エーテルの沸点が30-70℃のものの方が30-60℃のものよりRf値が小さくなる。

 Rf値 (石油エーテル30-60℃でアセトンとの体積比6:4、展開14分、室温15℃前後の場合) 
     (論文のグラフから池田が読み取った値)   
色素 カロテン クロロフィルa クロロフィルb ルテイン ビオラキサンチン ネオキサンチン
Rf 0.82 0.56 0.50 0.45 0.35 0.21

参考文献
 朝倉正海、2000.薄層クロマトグラフィの教材化に関する基礎的研究.展開時間とRf値について.生物教育学雑誌,11:13-18.

   小田原城内高等学校 生物部 『生物室』No.2(1968)より
   【pdfによる いろいろな緑葉のペーパークロマトグラフィー】小田原城


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